Главная


стоматологии москва

Гены V и С соединяются в В-лимфоцитах

Как правило, гаметные гены F, выявляемые в гаметной ДНК методом блоттинга по Саузерну, мигрируют отдельно от генов С, что согласуется с выводом о раздельном расположении генов V и С в гаметном геноме. Модель Дрейера — Беннета предсказывала, что экспрессии гена V в антителообразующей клетке должно предшествовать перемещение этого гена в гаметном геноме и соединение с геном С. Появление метода блоттинга по Саузерну позволило проверить эту гипотезу. Схема постановки эксперимента приведена на рисунке.

Выявление с помощью блоттинга по Саузерну перестроек в генах V- и С-областей иммуноглобулинов

На условно изображенном гене сайты расщепления EcoRI обозначены стрелками. В гаметной ДНК (верхний рисунок) V- и С-гены находятся
на неизвестном расстоянии друг от друга и при блоттинге по Саузерну обнаруживаются в EcoRI-фрагментах длиной соответственно 3 и 5 тпн. Зонд из F-области
гибридизуется также с некоторым числом родственных генов (полосы выше и ниже полосы в 3 тпн). В миеломной ДНК (нижний рисунок) гены V и С сблизились так,
что (в данном примере) участки EcoRI- расщепления между ними отсутствуют и они входят в состав одного и того же EcoRI-фрагмента длиной 6 тпн, который
гибридизуется с обоими зондами. Фрагменты исходного размера (прерывистые линии) могут сохраняться или не сохраняться в миеломах в зависимости от того,
присутствуют ли в них обе гомологичные хромосомы. (В некоторых миеломах присутствуют обе хромосомы, причем обе в перестроенном виде.)

Если ген V сближается с геном С, то при блоттинге миеломной ДНК, ристриктированной эндонуклеазой, гибридизующаяся с С-зондом полоса должна переместиться из положения, характерного для гаметной ДНК. Полоса, соответствующая новой, «перестроенной» ДНК, может стать больше, меньше или же случайно совпасть по размеру с гаметной полосой в зависимости от локализации сайта (F—С)-рекомбинации и расположения сайтов расщепления рестриктазой в участках, окружающих гены V и С. Если на ДНК воздействовать рестриктазой, сайт узнавания которой находится ближе к С-области, чем участок рекомбинации V — С (см. незаштрихованные треугольники на рисунке), то рекомбинация не повлияет на размер С-области. Аналогично этому в миеломе может перестроиться одна из полос F-области. При использовании рестриктазы, сайты узнавания которой расположены более благоприятно для рестрикции (показаны стрелками на рисунке), гибридизация как с С-, так и с F-зондом выявит один и тот же фрагмент ДНК. Результаты блоттинга по Саузерну миеломной ДНК подтвердили наличие «перестроенных» генов каппа-цепей в миеломах в отличие от иелимфоидиой ДНК Гены, служившие контролем (такие, как ген глобина), в миеломах изменены не были. Эти результаты подтвердили правильность гипотезы Дрейера — Беннетта и привели к пересмотру концепции, утверждающей, что во всех клетках организма набор генов идентичен.

Нормальный лимфоцит представляет собой диплоидную клетку, содержащую две копии аутосомных генов. Если (V — С)-рекомбинация приводит к возникновению активного гена х в одной из хромосом, то что происходит с копией гена С в гомологичной хромосоме? Если бы эта копия оставалась в неизмененной гаметной конфигурации, было бы легко объяснить аллельное исключение: неперестроенный аллель не мог бы экспрессироваться без «активации» путем рекомбинации V — С. Изучая этот вопрос методом блоттинга по Саузерну, Перри и др., анализировали ДНК из 30 различных мышиных миелом и обнаружили, что в 15 из них наряду с перестроенной ДНК имеется и «гаметная» полоса, а в 15 других — по 2 перестроенных полосы. Эти результаты противоречат приведенной выше простой модели аллельного исключения и ставят вопрос о природе перестройки во «втором» геноме этих клеток, что мы рассмотрим несколько позже.