Главная


аренда кабинета для психолога - https://centersunrise.ru/

Иммунодиффузия. Общие замечания

Гели и их свойства

Основная функция геля — локализация преципитата. Она становится возможной, если растворенные антигены и антитела легко диффундируют в геле, но образующиеся иммунные комплексы ввиду их величины остаются внутри ячеек геля. Благодаря локализации преципитата достигается следующее:

а. В множественных системах антиген-антитело отдельные компоненты реакции диффундируют с различной скоростью, обусловленной неодинаковой величиной молекул и их концентрацией. В связи с этим могут образовываться множественные пространственно разделенные преципитаты, т. е. создается возможность анализа множественных систем.

б. По форме и расположению преципитатов можно судить о диффузионных свойствах и, следовательно, об относительной молекулярной массе антигена или антитела.

в. Порядок расположения линий преципитации по отношению друг к другу позволяет делать выводы об полном или частичном иммунохимическом сходстве, а также об отсутствии такового.

г. Исходя из величины ареала и удаленности от линии старта иммунных комплексов, можно проводить их количественное определение.

Наиболее распространены гели агара и агарозы; гели желатины, пектина, крахмала, полиакриламида или ацетата целлюлозы применяются в реакциях иммунодиффузии реже.

Диффузия и преципитация в геле

При концентрации агара 20 г/л средний размер пор геля составляет 3 нм. Можно считать достоверным, что обычно применяемые концентрации геля от 3 до 15 г/л существенно не влияют на диффузию большинства компонентов реакции антиген-антитело. Поэтому для всех компонентов процесса до их соединения справедливы законы свободной диффузии. В соответствии со вторым законом Фика концентрация вещества (С) на определенном расстоянии от линии старта (h) является функцией времени (t)

D — коэффициент диффузии, зависит от температуры, вязкости среды и радиуса диффундирующей молекулы.

где R — универсальная газовая постоянная, N — число Авогадро, Т — температура в градусах Кельвина, η — вязкость среды, r — молекулярный радиус.

При прочих равных условиях D представляет собой постоянную величину. Это означает, что для получения сравнимых результатов при иммунодиффузии необходимо стандартизовать такие показатели, как концентрация геля, температура и время диффузии, концентрация антигенов и антител. Это особенно важно, когда к моменту оценки диффузия еще не завершена (простая линейная иммунодиффузии, простая радиальная иммунодиффузии в модификации Фехей и Мак-Келви). Встреча компонентов реакции антиген-антитело изменяет или прекращает свободную диффузию. Последнее имеет место в случае образования стойких преципитатов, например при простой или двойной радиальной иммунодиффузии. Важно отметить, что наиболее выраженная преципитация наблюдается в зоне эквивалентности. Оптимальную пропорцию можно определить при взаимном проникновении компонентов реакции. Это становится более понятным из рисунка.

Схематическое изображение процессов, протекающих при двойной иммунодиффузии

Схематическое изображение процессов, протекающих при двойной иммунодиффузии

1 — градиент концентрации антигенов и антител вскоре после внесения растворов в резервуары;
2 — первый контакт партнеров реакции;
3 — процесс диффузии в основном окончен, преципитат полностью сформирован.

В данном случае мы полагаем, что два наиболее важных фактора образования преципитата — коэффициент диффузии и относительные концентрации — примерно равны. В месте первого контакта молекул антигена и антитела (линия 2) образуются преципитаты, которые увеличиваются в размерах по мере поступления эквивалентных количеств партнеров реакции. Преципитация становится полной при нивелировании градиента концентрации (линия 3). По Ухтерлони система называется сбалансированной, если место первого образования иммунных агрегатов и место их последующего отложения совпадают. Если один из компонентов реакции диффундирует медленнее, чем другой, то комплексы антиген-антитело, возникшие при первом контакте, медленно растворяются вследствие смещения зоны эквивалентности под влиянием притока более медленно диффундирующего партнера компонента. Вновь образующиеся комплексы формируются все ближе и ближе к резервуару быстро диффундирующего компонента.

В соответствии с вышеизложенным в данном случае можно говорить о несбалансированной системе. Перемещение линии преципитации является, таким образом, следствием образования преципитата, распада комплексов, повторного выпадения преципитатов и т. д.

Факторы, влияющие на преципитацию

Образование первичных комплексов после контакта антигенов и антител происходит в течение нескольких минут. Для полной преципитации необходимо 24—48 часов. Для высокомолекулярных компонентов при наличии «слабых» сывороток время полной преципитации увеличивается до 8 дней. Температура не играет особой роли, она может быть 0—4 °С, 20 °С или 37 °С. Антисыворотки лошади дают лучшую преципитацию при температуре, ниже комнатной; эта закономерность отсутствует при использовании сыворотки морской свинки. Колебания рН в пределах 6,4—8,5 на процесс преципитации влияния не оказывают. АС млекопитающих дают оптимальную преципитацию при физиологических концентрациях NaCl; АС птиц лучше преципитируют специфические антигены в средах с высокой ионной силой, например, в 1,2 М NaCl. Наличие детергентов, органических растворителей, мочевины и других соединений может препятствовать образованию иммунных агрегатов. Они могут вызывать денатурацию или распад молекул белка на субъединицы. АС лошади, как правило, дают преципитацию в зоне эквивалентности (обычно довольно широкая), они образуют резкие тонкие полосы. Преципитаты, образуемые АС морских свинок или АС «типа морских свинок» со специфическими антигенами, образуют более широкие зоны. При избытке антител такого типа образуются так называемые «флаги», «шлейфы» и др. Преимуществом сывороток «типа морской свинки» является возможность исследовать с их помощью обширную область концентраций, так как даже при избытке антител возникают преципитирующие комплексы.

Классификация методов иммунодиффузии

Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором оба, в зависимости от того происходит ли диффузия по одной общей оси или во все стороны радиально, из резервуара в среду. иммунодиффузии называется линейной или радиальной. Даже расположенные под углом друг к другу резервуары представляют известные удобства для определенных целей. Общая схема методов диффузии представлена на рисунке:

Схема классификации методов иммунодиффузии по Ухтерлони

Темные области — растворы антигенов;
заштрихованные области — антитела или гель с антисывороткой;
белые области — нейтральный гель.

Системы антиген—антитело

В зависимости от состава различают простые, сложные и множественные системы. В простых системах антиген, несущий детерминанту «а», реагирует с антителом, несущим антидетерминанту «анти-а». В результате взаимодействия антигенов с антителами в геле появляется линия преципитации. Если молекула антигена содержит несколько детерминант различной структуры (а, b, с), к каждой из которых в сыворотке имеются соответствующие антитела со специфичностью А, В, С, то в этом случае образуется только одна линия преципитации, т. е. система является простой. К сложным системам относят такие, в которых ввиду структурного сходства различных молекул антигенов наблюдаются перекрестные реакции. О множественных системах говорят в тех случаях, когда одновременно происходят реакции нескольких простых или сложных систем. Эти данные приведены на рисунке.

Варианты систем антиген-антитело при постановке реакции иммунодиффузии

Варианты систем антиген-антитело при постановке реакции иммунодиффузии

Специфичность, чувствительность, ошибки метода

Высокая специфичность представляет собой важнейшее преимущество методов иммунологического анализа. Для количественного или качественного определения изучаемого антигена в растворе нескольких веществ необходимо иметь соответствующие моноспецифические сыворотки. Моноспецифичность проверяют в данном случае методом двойной радиальной иммунодиффузии или методом иммуноэлектрофореза, при необходимости нежелательные антитела устраняются адсорбцией. Что касается чувствительности методов иммунодиффузии, то, согласно мнению многих авторов, при концентрации белка 50—5 мкг/мл в соответствующих системах антиген-антитело еще можно наблюдать образование преципитатов. Если в лунку вносят 2—10 мкл раствора, то удается определить присутствие белка в растворе в количестве 10—500 нг. Разброс данных при постановке серии количественных определений составляет около 5% (3—7%).