Главная


Ботаника магазин цветов Доставка цветов в Бийске.

Разделение клеток при помощи адгезии

Разделение клеток на стеклянных гранулах
Фракционирование клеток на найлоновых волокнах

Фагоцитирующие клетки, в том числе и часть лимфоцитов, имеют тенденцию к адгезии на твердых поверхностях. Это относится в первую очередь к В-лимфоцитам, особенно к антителообразующим клеткам. Супрессоры, которые в основном относятся к Т-клеткам, встречаются также среди макрофагов и В-лимфоцитов. Механизм адгезии еще полностью неясен, известно только, что адгезия тем легче, чем меньше отрицательный потенциал клетки. Различают две формы адгезии. У фагоцитов это активный процесс, зависящий от интенсивности метаболизма и от температуры. Эти клетки могут быть отделены от твердой фазы при помощи сред, не содержащих Са2+ и Mg2+ или содержащих ЭДТА. Адгезия лимфоцитов не зависит от температуры и наличия ЭДТА, но подвержена влиянию концентрации белка в среде. Для разделения клеток в настоящее время используют стеклянные и плексигласовые гранулы, сефадекс и найлон.

Разделение клеток на стеклянных гранулах

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: стеклянная колонка с рубашкой, термостат с циркуляционным насосом, стеклянные бусы диаметром 0,3—0,5 мм (тип R-50, Trisola, Штейнах), H2SO4 концентрированная, стальное сито без следов ржавчины, фильтровальная ткань, телячья сыворотка, среда MEM с рН 7,2, среда Рабиновича (0,02% ЭДТА в свободной от Са2+ и Mg2+ ФСБ).

Получение суспензии клеток. Селезенку и лимфатические узлы (обычно мышиные) погружают в среду MEM, содержащую 10% сыворотки телят, разрезают на маленькие кусочки и осторожно продавливают шпателем через мелкую стальную сетку. Клетки дважды отмывают в среде MEM, ресуспензируя их и центрифугируя в течение 5 мин при 500 g. Агрегаты удаляют фильтрованием через тонкую ткань. Перитонеальные клетки получают путем смыва с брюшины средой при помощи шприца. Выделение лейкоцитов крови проводят по методу Бёйюма. В зависимости от вида животных градиент плотности может быть различным.

Подготовка колонки. Размер колонки в зависимости от количества и видовой принадлежности клеток может изменяться от 1,5 до 4,0 см в диаметре и от 10 до 80 см по высоте. Стеклянные очищают концентрированной H2SO4 и отмывают дистиллированной водой до исчезновения следов кислоты. Колонка должна быть оборудована снизу краном, а сверху — воронкой:

Схема устройства для фракционирования клеток на стеклянных гранулах

Схема устройства для фракционирования клеток на стеклянных гранулах

1 — охлаждающая рубашка; 2 — термостат; 3 — марля; 4 — среда; 5 — кран закрыт; 6 — кран открыт

Колонку затыкают снизу марлей и заполняют средой MEM до половины воронки. Затем небольшими порциями вносят гранулы до нужной высоты. Колонку промывают 5 объемами MEM с 10% телячьей сыворотки и охлаждают до 4°С. Если разделение должно проводиться при 37°С, то колонку, среду, гранулы и прочее оборудование перед заполнением нагревают при 37 °С для предотвращения образования пузырей.

Разделение фагоцитирующих клеток и лимфоцитов. Перед нанесением клеток уровень жидкости в колонке опускают до уровня носителя. Затем подогретые до 37°С клетки наносят па колонку со скоростью 2—3 мл/мин. Для разделения 2х106 клеток в 10 мл среды достаточно колонки размером 2x20 см. Колонку закрывают и инкубируют. Сливают через 15 мин 1 мл среды и инкубируют колонку еще в течение 30 мин. Все неадгезировавшие клетки удаляют пропусканием через колонку 300 мг MEM со скоростью 2—3 мл/ч.

Элюцию адгезированных клеток проводят 200 мл буфера Рабиновича, причем скорость элюции составляет 2—3 мл/мин для первых 100 мл, повышаясь далее до 5 мл/мин. Не рекомендуется проводить элюцию путем перемешивания гранул в колонке, поскольку при этом могут высвобождаться лимфоциты, не элюируемые ЭДТА.

Разделение Т- и В-лимфоцитов. Суспензию лимфоцитов (2х108) наносят со скоростью 2—3 мл/мин на колонку размером 1,5x80 см и выдерживают при 4°С. Преинкубация стеклянных гранул с 10% телячьей сывороткой или добавление 5% сыворотки к среде приводит к снижению адгезивных свойств Т-лимфоцитов. После того как жидкость, содержащая лимфоциты, нанесена на колонку (150 мл), носитель выбивают.. Для этого нижний кран осторожно вынимают (верхний закрыт), заливают в воронку среду и, осторожно открывая верхний кран, собирают гранулы в химический стакан (рисунок б и в). Адгезированные В-лимфоциты отделяют от стеклянных гранул осторожным встряхиванием в течение 30—60 секунд в 150 мл среды MEM. Содержащую клетки среду собирают. Клетки обеих фракций лимфоцитов собирают центрифугированием и отмывают 1 раз (500, 5 минут).

Удаление или накопление антителообразующих клеток. Для специфической элиминации антителообразующих клеток используют гранулы, нагруженные антигеном (инкубация с антигенами в течение 60 минут при 45 °С, концентрация антиген 5 мг/мл); на колонку расходуется около 20 мл раствора антигена. После добавления телячьей сыворотки (до 10%) гранулы выдерживают еще 60 мин при 37 °С или в течение ночи в холодильнике. Перед заполнением колонки гранулы отмывают от антигена (расходуется около 500 мл среды). Нанесение на колонку и разделение клеток описано выше.

Оценка результатов. При использовании всех трех вышеописанных методов нужно учитывать видовое и органное происхождение клеток, отсюда — возможные модификации. Что касается лейкоцитов крови человека (Т-лимфоциты или фагоцитирующие клетки), можно добиться 90% обогащения, в то время как при работе с селезенкой мыши такого результата можно достичь только в отношении лимфоцитов. При разделении Т- и В-лимфоцитов на адгезионных колонках (стеклянные гранулы, дегалан) обогащение Т-лимфоцитов колеблется от 70 до 90% (выход Т-лимфоцитов во фракции клеток, не собиравшихся на колонку, составляет около 50%). Обогащение В-лимфоцитов колеблется в пределах 70—80% (адгезивная фракция), причем выход составляет 30—40%. В вышеприведенном примере использовали спленоциты мыши. Хотя нагруженные антигенные колонки и удерживают специфические антителообразующие клетки, этот эффект усилен весьма незначительно по сравнению с неспецифической адгезией антителообразующих клеток на различных материалах, например на сефадексе. Элиминация антителообразующих клеток из неадгезированной фракции в зависимости от иммуно-гена и периода иммунизации может составлять 60—100%. Максимально удается достичь 2—3-кратного концентрирования антителообразующих клеток, поскольку их доля в адгезивной фракции составляет в среднем 30—40%.

Фракционирование клеток на найлоновых волокнах

Материалы и методы. Для работы необходимы: найлоновая вата (LP-1 Leuko Рак, Leukozytenfilter, FENWAL Labs. США, или Semidull Nylon Staple 3 den. 11/2 in 200 E.I. Dupont, США), шприцы на 10 или 20 мл среды: MEM или Dulbecco ФСБ с добавлением 5% телячьей сыворотки; ФСБ).

Этапы работы. Токсические вещества удаляют из найлоновой ваты отмыванием дистиллированной водой и ФСБ в термостате. Вату (0,7 или 1,4 г) набивают в шприц до отметки 6 мл или 12 мл соответственно. При необходимости возможно автоклавирование. Колонку (шприц) промывают 20—30 мл среды и инкубируют в течение 1 минуты при 37 °С. Перед нанесением клеток через шприц еще раз пропускают 20 мл нагретого буфера, причем уровень жидкости должен дойти до края ваты. Клетки, подогретые до 37 °С, наносят на колонку со скоростью 1,0 мл/мин; на колонку объемом 6 мл наносят 100 -150х106 клеток в 2,0 мл, на колонку объемом 12 мл — 200-300 х106 клеток в объеме 4,0 мл, после чего добавляют еще 0.5.1,0 мл среды. Колонку в вертикальном положении инкубируют в течение 45 мин при 37 °С. Элюцию осуществляют пропусканием 30 или 60 мл разделяющей среды со скоростью 2—3 мл/мин. Затем для удаления слабо связанных клеток промывают колонку 50—60 мл среды со скоростью 5—6 мл/мин, эти немногочисленные клетки отбрасывают. Отделение адгезированных клеток осуществляют 5—6-кратным сдавленней ваты поршнем шприца. В промежутках между сжатиями поршня найлоновую вату расправляют в новой порции среды. Жидкость объединяют, клетки собирают центрифугированием.

Оценка метода. Фракционирование на найлоновой вате представляет собой простой и быстрый метод разделения Т- и В-лимфоцитов. Это наиболее часто применяемый метод. Данные о степени чистоты получаемых клеточных популяций варьируют у различных авторов. На адгезирующие спленоциты мыши после 1-кратного пропускания через колонку приходится еще 10—20% В-лимфоцитов. На колонке преимущественно задерживаются антителообразующие клетки и фагоцитирующие клетки, однако в виде примеси присутствует 10—20% Т-лимфоцитов. В обеих фракциях выход составляет не более 25—50% от исходного числа клеток. Элиминация Ig-положительных клеток из лимфоцитов крови человека составляет также около 50%. Различия в эффективности разделения могут быть обусловлены также свойствами разделяющих материалов.

Артефакты. В зависимости от состава клеточной суспензии, который редко бывает постоянным, к носителю могут прикрепляться клетки с различной активностью. Это замечание относится не только к фагоцитам, но теоретически также к стимулированным лимфоцитам и супрессорным клеткам. В случае небольшого выхода клеток отмечается также «эффект сита». Этот эффект может наблюдаться при использовании стекла, дегалана, найлоновой ваты, материалов для аффинной хроматографии, обработанных лигандами для клеточных рецепторов, а затем сывороткой. Эффект неспецифического связывания наблюдается почти всегда. Кроме того, описаны 4 специфических источника артефактов для найлона.

1. Адгезия Tk-клеток, которая является одной из причин (помимо утраты К-клеточной активности после обработки хлоридом аммония) того, что в первые годы после открытия Т-лимфоцитов их вычеркнули из числа кандидатов в К-клетки.

2. У Т-лимфоцитов мыши из селезенки, лимфатических узлов или тимуса после контакта с найлоновой ватой может наблюдаться изменение «Homing»-эффекта.

3. Т-лимфоциты человека, разделенные на найлоновой вате, перестают действовать в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) как стимуляторы. Причем до настоящего времени неясно, удаляются при этом клетки-стимуляторы или вспомогательные клетки.

4. После контакта с найлоновой ватой Т-лимфоциты мыши реагируют на антигены сильнее, чем до сепарации. Объяснением этого факта скорее может служить адгезия предшественников супрессорных клеток, чем активация антигеноспецифических лимфоцитов после сепарации.

Следует указать, что материалы, обладающие выраженным адгезивным эффектом, нельзя применять для разделения клеток.